如何使用光學(xué)顯微鏡

顯微鏡是研究微生物學(xué)的重要工具之一，根據(jù)不同的研究目的和要求，可以分別選用普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等，在食品微生物檢測中，以普通光學(xué)顯微鏡(簡稱顯微鏡)zui為常用。

光學(xué)顯微鏡通常采用兩級放大，分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體位于物鏡的前方，被物鏡做第-一級放大后成，倒立的實像，然后此實像再被目鏡做第二級放大成虛像，人眼看到的就是一虛像，而顯微鏡的總放大倍率就是物鏡放大倍率和目鏡放大倍率的乘積。

光學(xué)顯微鏡是利用光學(xué)原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器。光學(xué)顯微鏡就是利用表面為曲面的光學(xué)透鏡使物體放大成像這一原理，把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。



放大倍率是指直線尺寸的放大比，而不是面積比。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率，顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的zui小間距。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又相互有關(guān)聯(lián)的概念。



當選用的物鏡分辨率不夠高(數(shù)值孔徑不夠大)時，顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu)，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只是一個輪廓大但細節(jié)不清晰的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已經(jīng)滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。



一、顯微鏡的使用方法

（一)對光

(1)鏡檢時身體要正對實驗臺，采取端正的姿態(tài)，調(diào)整兩個目鏡之間的距離與觀測者瞳距相符，兩眼自然睜開，同時左手調(diào)節(jié)焦距，使物像清晰并移動標本視野，右手記錄、繪圖。將低倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方與鏡筒成一直線。鏡檢時載物臺不可傾斜，因為當載物臺傾斜時，液體或油易流出，既損壞了標本，又污染載物臺，也影響檢查結(jié)果。

(2)利用自然光源鏡檢時，zui-好用朝北的光源，不宜采用直射陽光；利用人工光源時，用日光燈的光源。轉(zhuǎn)動底部光源或撥動反光鏡，調(diào)節(jié)視野亮度。反光鏡有平、凹兩面，光源強時用平面，較暗時用凹面，需要強光時，將聚光器提高，光圈放大；需要弱光時，將聚光器降低，或光圈適當縮小。

(3)將待觀察的標本置載物臺上，載物臺上有固定的裝置固定標本(見圖3)。通過載物臺調(diào)節(jié)旋鈕將標本移至鏡筒下方。轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒下降至物鏡 鏡接近標本。于轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋的同時，需俯身在鏡旁仔細觀察物鏡與標本之間的距離。

(4)調(diào)節(jié)目鏡之間距離，雙眼分別于左、右目鏡中觀察，待雙眼視野重合，同時左手轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使鏡筒徐徐上升以調(diào)節(jié)焦距，使視野內(nèi)的物像看到時即停，再調(diào)細準焦螺旋，至標本清晰為止。



(二)物鏡的使用

顯微鏡一般具有三個物鏡，即低倍、高倍及油鏡，固定于物鏡轉(zhuǎn)換盤孔中。觀察標本時，使用低倍物鏡，此時，視野，標本較易查出，但放大倍數(shù)較小(一般放大100倍),較小的物體不易觀察其結(jié)構(gòu)。高倍物鏡放大的倍數(shù)(一般放大400倍),能觀察微小的物體或結(jié)構(gòu)。油鏡放大倍數(shù)可達1000倍，用來觀察細菌。



(三)低倍、高倍、油鏡頭的識別

(1)標明放大倍數(shù)10×、40 ×、100 x，或10/0.25、40/0.65、 100/1.30。

(2)低倍鏡zui短，高倍鏡較長，油鏡zui長。

(3)鏡頭前面的鏡孔低倍鏡zui大，高倍鏡，油鏡zui小。

(4)油鏡頭上?？逃泻谏h(huán)圈，或“Oil"或“油”字



(四)低倍鏡換高倍鏡的使用方法

(1)光線對好后，捻轉(zhuǎn)載物臺調(diào)節(jié)旋鈕尋找需要觀察的標本。

(2)如標本的體積較小，不能清楚查看其構(gòu)造因而不能確認時，則將標本移至視野中央，再旋轉(zhuǎn)高倍物鏡于鏡筒下方。

(3)旋轉(zhuǎn)細準焦螺旋至物象清晰為止。

(4)調(diào)節(jié)聚光器及光圈，使視野內(nèi)的物象達到zui清晰的程度。



(五)油鏡的使用方法

(1)將光線調(diào)至zui強程度(聚光器提高，光圈全部開放，亮度調(diào)節(jié)旋鈕或光源放至zui大）。

(2)將標本固定在載物臺上，先把低倍鏡調(diào)至視野zui亮，并找到標本視野的適當位置，然后才能換用油鏡。

(3)轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒上升，滴香柏油1小滴(不要過多，不要涂開)于物鏡正下方標本上。

(4)轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換盤，使油鏡頭于鏡筒下方。

(5)俯身鏡旁側(cè)面，在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止。但勿使兩者相碰，防止損傷鏡頭或玻片。

(6)慢慢轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使油鏡頭徐徐上升至見到標本的物象為止。

(7)轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，使視野物象達到zui清晰的程度。

(8)左手徐徐移動載物臺調(diào)節(jié)旋鈕，并轉(zhuǎn)動細準焦螺旋以觀察標本。

(9)標本觀察完畢后，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋將鏡筒升起，取下標本玻片。立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈，再用干凈的擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，zui后用干凈的擦鏡紙將鏡頭上的二甲苯擦去。注意在擦鏡紙擦拭時，要求順著一個方向旋轉(zhuǎn)擦拭，不能兩個方向來回擦。



(六)觀察

初學(xué)者應(yīng)先用低倍鏡觀察，這是因為低倍鏡視野的實際范圍zui大，易于發(fā)現(xiàn)目的物，將標本玻片放在載物臺上(注意標本朝上),并使標本位于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，同時從側(cè)面觀察，待物鏡下降到標本約0.5cm時，開始由目鏡觀察，同時用粗準焦螺旋升起鏡筒，直到出現(xiàn)物象后，改用細準焦螺旋，上下微微轉(zhuǎn)動，仔細調(diào)節(jié)焦距，直至zui后獲得清晰的物象為止。如此時視野里所觀察到的部位不理想時，可利用載物臺調(diào)節(jié)旋鈕將zui適合的部位移動到視野中央。



由低倍鏡轉(zhuǎn)換到高倍鏡時，一定要從側(cè)面注視，以防低倍鏡未對好焦距而造成鏡頭與玻片相撞，另外要用手指捏住轉(zhuǎn)換器下面的金屬盤使之旋轉(zhuǎn)，而不得用手指捏住物鏡來轉(zhuǎn)動，否則使用后，會使光軸歪斜。調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使亮度適中，再仔細轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象。



細菌或其他標本的細微結(jié)構(gòu)，都需要用油鏡觀察，由于油鏡的工作距離很短(0. 19mm左右),故使用時必須特別小心。在低倍鏡找到要觀察的部位以后，將鏡筒升高，在標本上加一滴香柏油，轉(zhuǎn)換鏡頭，從側(cè)面注視，用粗準焦螺旋將鏡筒小心下降，使油鏡浸入油滴，直到幾乎與標本接觸為止(注意切勿壓在標本上，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡鏡頭)。從目鏡觀察，先用粗準焦螺旋徐徐升起(只準上升鏡筒，不能向下調(diào)節(jié)),當視野中有模糊的標本物象時，改用細準焦螺旋調(diào)節(jié)，直到標本物象清晰為止，如轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋已使鏡頭離開油鏡，應(yīng)重新調(diào)節(jié)，直至調(diào)到看清物象為止。



(七)顯微鏡的保養(yǎng)

(1)移動顯微鏡時，右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，勿傾斜，輕輕取出。不要只用一只手提取，以防顯微鏡墜落。然后輕輕放在實驗臺上。注意在任何情況下都不要嘗試同時拿起兩臺顯微鏡。



(2)顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時與臺面接觸，這樣會導(dǎo)致震動過大，透鏡和細準焦螺旋的裝置易損壞。



(3)顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。如透鏡部分不潔時，用擦鏡紙輕擦，如有油污，將擦鏡紙蘸少許二甲苯拭去。尤其在使用油鏡后。檢驗?zāi)跨R是否干凈的zui-好方法是在使用顯微鏡觀察時，用拇指和手指旋轉(zhuǎn)目鏡，通過鏡頭上的灰塵是否運動來判斷。如果通過清理目鏡上方起不到清除灰塵的效果，就應(yīng)該清理目鏡的下方，并用特殊的空氣罐工具吹走多余的擦鏡紙棉絨。如圖4當目鏡被拿下清理的時候，應(yīng)該用擦鏡紙遮蓋目鏡敞開的部分，用特殊的空氣噴射裝置吹去灰塵和多余的棉絨。



(4)強酸、強堿、酒精、乙醚等都能去漆或損壞機件，需注意不使接觸機件。

(5)顯微鏡不能在陽光下暴曬和使用。

(6)目鏡和物鏡不要隨便抽出和卸下。必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。

(7)顯微鏡用完后，取下標本片，經(jīng)聚光器降下，再將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒下降，以免物鏡與聚光器相碰。然后放入鏡箱，或鏡外加蓋塑料防塵罩。

(8)顯微鏡應(yīng)放在干燥的地方，以防生霉。

(9)顯微鏡是貴重的精密儀器，使用時要加以愛惜，切勿隨意拆散玩弄。

二、顯微鏡的光路

目鏡是顯微鏡頂部一個非常復(fù)雜的部件，它由兩個或兩個以上的內(nèi)部透鏡組成，通常擁有10倍的放大倍數(shù)。雖然圖2的顯微鏡示意圖給出的是雙目顯微鏡，但是也有單筒目鏡的顯微鏡。另一個重要的部件是物鏡，通常顯微鏡都有可以旋轉(zhuǎn)的鏡梁，有利于物鏡對玻片的觀察。大部分實驗室的顯微鏡物鏡的放大倍數(shù)通常為:10倍、45倍和100倍，鏡頭上長標記的英文：low power（低倍），high-dry（高倍）和oil immersion (油鏡).有的顯微鏡可能會有四個鏡頭，但是zui小的放大倍數(shù)只有4倍。





顯微鏡的第三個重要部件為聚光器，它位于載物臺下方，收集由燈(光源)發(fā)出的光，射到載玻片。聚光器可以由載物臺下方的一個旋鈕調(diào)節(jié)升降。聚光器中有一個光圈可以調(diào)節(jié)透過光的劑量。如果顯微鏡缺乏電壓來調(diào)節(jié)光源就主要依靠光圈來調(diào)節(jié)光源的強度。圖1所示的Olympus顯微鏡的光圈是通過調(diào)節(jié)一個凸邊的圓圈來調(diào)節(jié)光的強度的。圖2顯示了顯微鏡的光路情況。



三、分辨率

顯微鏡透鏡系統(tǒng)的分辨率取決于光圈的數(shù)值孔徑、光的波長和聚光器的設(shè)計。zui0好的顯微鏡的油鏡的分辨率一般在0.2 um.這就意味著兩個相距0.2 um的物體用顯微鏡觀察就感覺是兩個獨立的個體。但是如果相距小于0.2 um,那么兩個小物體就被認為是一個物體。想要使顯微鏡的分辨率得到zui大的發(fā)揮，以下因素是必須考慮的：

(1)在光源的上方添加藍的濾光片，因為短的藍光波長可以提供更大的分辨率。

(2)聚光器需要放在zui高的位置上，這樣可以使光zui大限度的到達目標處。

(3)光圈不能停在靠下的位置。盡管光圈靠下可以提高對比度，但是它會使光圈的數(shù)值孔徑變小。

(4)油鏡需要在載玻片和100倍的目標之間使用。

必須注意的是放大率增大，分辨率必須增大。但是單純的增加放大率，比如使用20倍目鏡是不能增加分辨率的。



四、顯微鏡的構(gòu)造



(一)光學(xué)部分

1.物鏡

該鏡頭下端接近被檢物體，為顯微鏡上的主要光學(xué)裝置。由多塊透鏡組成。一般顯微鏡具有3個-4個物鏡，分成干燥系和油鏡兩組，干燥系又按放大倍數(shù)分為低倍鏡和高倍鏡。各物鏡放大率由其外形辨認，鏡頭長度越大，鏡片口徑越小，放大倍數(shù)愈大；反之，放大倍數(shù)小。油鏡頭的下緣，一般刻有一圈黑線。此外，各物鏡上都刻有放大倍數(shù)、孔徑數(shù)等標志



2.目鏡

目鏡重要的光學(xué)部分之一，和鏡檢者的眼睛接近。目鏡由兩塊透鏡組成，其上刻有倍數(shù)。為便于指出物象，常在鏡中裝黑色細絲一條，作為指針。



3.聚光器

聚光器位于載物臺下方的次臺上，由數(shù)個透鏡組成。能上下移動，調(diào)節(jié)并集聚由光源提供的光線，使集中于載物玻片上。



4.光源

光源提供觀察所需光線，裝在顯微鏡的zui下方。



(二)機械部分

1.鏡臂

鏡臂在鏡筒后面，便于顯微鏡搬移，并作為將鏡筒傾斜時的握持部。



2.底座

顯微鏡的底座用以支持全鏡，呈馬蹄形。



3.載物臺

在物鏡下方，呈方形或圓形，用以載放被檢物體。中央有孔，可以透光。臺上裝有一彈簧夾，鏡檢時可以固定標本片。有的載物臺上裝有載物臺調(diào)解旋鈕，捻轉(zhuǎn)旋鈕，能使標本前后左右移動。



4.光圈

在聚光器下方，可以任意開閉，用以調(diào)節(jié)射入集光線的多寡。



5.電源和亮度調(diào)節(jié)旋鈕

用于開啟光源和調(diào)節(jié)光源的亮度。



6.粗準焦螺旋和細準焦螺旋

粗準焦螺旋可使載物臺距離地升降。細準焦螺旋可以精確地調(diào)節(jié)距離。