1．CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
（1）優(yōu)點(diǎn)
CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，既可以貼壁生長(zhǎng)。也可以懸浮生長(zhǎng)。目前常用的CHO細(xì)胞包括原始CHO和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(DHFR-)突變株CHO。近年來(lái)，為降低生物試劑成本和減少血制品帶來(lái)的潛在危害性，動(dòng)物細(xì)胞生物試劑開(kāi)始使用無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)，但SFM往往導(dǎo)致細(xì)胞活力差，貼壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺點(diǎn)。另有研究者嘗 試將類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子IGF基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級(jí)CHO”，無(wú)需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細(xì)胞可在SFM中生長(zhǎng)良好。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO表達(dá)系統(tǒng)具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
(1)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面zui接近于天然蛋白分子； 
(2)既可貼壁生長(zhǎng)，又可以懸浮培養(yǎng)，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；
(3)具有重組基因的擴(kuò)增和表達(dá)能力，外源蛋白的整合穩(wěn)定；
(4)具有產(chǎn)物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；
(5)能以懸浮培養(yǎng)方式或在無(wú)血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度培養(yǎng)。且培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L以上，可以大規(guī)模生物試劑。
（2）存在的問(wèn)題 
在過(guò)去的幾十年里，人類(lèi)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究開(kāi)發(fā)，取得了很大進(jìn)展，但是利用CHO細(xì)胞表達(dá)外源基因的技術(shù)水平尚不能滿足生物藥品的開(kāi)發(fā)和生物試劑的要求，目前上游工作中主要存在以下問(wèn)題：
①構(gòu)建的重組CHO細(xì)胞生物試劑效率低，產(chǎn)物濃度亦低；
②某些糖基化表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化；
③重組CHO細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)在上游構(gòu)建時(shí)著重考慮它的表達(dá)，而對(duì)高教表達(dá)的產(chǎn)物是否能有效地提取出來(lái)，即分離純化過(guò)程考慮較少；
④重組細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)用昂貴，自動(dòng)化水平低下。 

2．畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
（1）特點(diǎn)
自1987年Gregg等在畢赤酵母中表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多種外源蛋白在畢赤酵母宿主菌中獲得表達(dá)。而zui近幾年每年報(bào)道的在畢赤酵母中表達(dá)的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)： 
1）含有*的強(qiáng)有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)； 
2）表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)。畢赤酵母中，報(bào)道的zui高表達(dá)量為破傷風(fēng)毒素C為12g/l，一般大于1g/l。絕大多數(shù)外源基因比在細(xì)菌、釀酒酵母、動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)水平高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有指導(dǎo)分泌的信號(hào)肽序列，使表達(dá)的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，有利于分離純化； 
3）發(fā)酵工藝成熟，易放大。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生物試劑的發(fā)酵工藝，且細(xì)胞干重達(dá)100g/l以上，表達(dá)重組蛋白時(shí)，已成功放大到10000升； 
4）培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無(wú)機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導(dǎo)物一般為價(jià)格較高的半乳糖； 
5）外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失； 
6）作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。
（2）存在的問(wèn)題
盡管甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是發(fā)展前景的真核表達(dá)系統(tǒng)，許多表達(dá)產(chǎn)物已用于治療及預(yù)防，但它并不是的表達(dá)系統(tǒng)，作為一種新的表達(dá)系統(tǒng)，和其它表達(dá)系統(tǒng)一樣，巴氏系統(tǒng)也并非盡如人意，同樣有其局限性，仍然存在這樣或那樣的缺陷或不足。如分泌產(chǎn)物的不均一性，包括聚合體的存在，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，易污染，且長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵不利于外源蛋白的表達(dá)；利用易燃的甲醇做原料，表達(dá)產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮；篩選藥物價(jià)格昂貴也給生物試劑應(yīng)用帶來(lái)局限；低表達(dá)或不表達(dá)的例子也在增多。信號(hào)肽加工不*，修飾功能欠完善以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象，給外源蛋白的純化和工業(yè)化帶來(lái)了困難。而且，與安全可靠、背景清楚的釀酒酵母相比，巴氏系統(tǒng)還有其它缺點(diǎn)：
(1)分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)改造困難。
(2)不是一種食品微生物，發(fā)酵時(shí)又要添加甲醇， 所以，要用它來(lái)生物試劑藥品或食品還沒(méi)有被廣泛接受。
(3)發(fā)酵雖然能達(dá)到很高的密度，但是發(fā)酵周期一般較長(zhǎng)。
其中zui重要的一個(gè)缺陷就是分泌表達(dá)的蛋白在培養(yǎng)基中被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度發(fā)酵，蛋白酶也會(huì)隨著細(xì)胞密度的增高而增高。
下面三種方法可以在發(fā)酵過(guò)程中有效降低外源蛋白的降解：①添加富含氨基酸的添加劑，如：胰蛋白胨，它們可以作為蛋白酶的底物被分解而減少目的蛋白的降解；②改變培養(yǎng)基 pH值，由于畢赤酵母可以在pH值為3.0~7.0的范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)，調(diào)節(jié) pH值可以改變蛋白酶的活性，從而減少蛋白質(zhì)的降解；③應(yīng)用蛋白酶缺陷型菌株，如：SMD1163、1165、1168。
其次，有些蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量很低或不表達(dá)，原因至今尚未*闡明，但可能與以下幾方面有關(guān)：
①畢赤酵母與人及其它物種一樣對(duì)所使用的氨基酸密碼子具有不同的偏好性，這可能限制其蛋白質(zhì)翻譯速度。比較 110種酵母基因密碼子使用情況發(fā)現(xiàn)，所有基因可分為明顯的兩組：高表達(dá)組和低表達(dá)組。高表達(dá)組基因的密碼子相應(yīng)的tRNA也明顯高于低表達(dá)組，第三位密碼子為胞嘧啶的比例也明顯升高，AT含量則比較低。鑒定酵母和人類(lèi)使用頻率zui低的密碼子發(fā)現(xiàn)：8個(gè)低頻密碼子中有6個(gè)是一樣的，無(wú)論大腸桿菌，果蠅，還是酵母和人類(lèi)，大量表達(dá)的蛋白基因中低頻密碼子則明顯減少，低頻密碼子含量高的蛋白質(zhì)大量表達(dá)都是對(duì)其自身有害的。為了在畢赤酵母中表達(dá)HIV-2外殼糖蛋白gpl05，Zhang YJ等將低頻密碼子AGG突變?yōu)橥吹腃GA，編碼天冬氨酸的GAT突變?yōu)榫幋a谷氨酸的 GAA，并引入了酵母偏好的TCC，zui終實(shí)現(xiàn)了gpl05在其中的高表達(dá)；
②當(dāng)整合拷貝數(shù)增多后，可能在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生后生(Epigenetic)的調(diào)節(jié)，影響重組蛋白產(chǎn)率的提高；
③轉(zhuǎn)錄提前終止，這主要是因?yàn)锳T含量過(guò)多引起的。據(jù)報(bào)道HIV．1 gpl20就是因?yàn)樵贏T豐富區(qū)因轉(zhuǎn)錄提前終止而不能在畢赤酵母中表達(dá)，在釀酒酵母中有一些共有序列，類(lèi)似于HIV-1gpl20中引起轉(zhuǎn)錄提前終止的AT豐富區(qū)域，如：TTTTATA，當(dāng)改變這些序列后，就可發(fā)現(xiàn)更長(zhǎng)的mRNA出現(xiàn)。

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